肌球蛋白是肉及肉制品中最主要的蛋白质，约占肌肉总蛋白的1/3，是蛋白功能特性的主要承担者，对肉制品品质起关键性作用。迷迭香是肉制品加工、贮藏等过程中常见的调料，赋予了产品特殊风味并起到抗氧化等作用，其中起主要作用的成分为多酚类化合物。迷迭香酸（RA）是一种水溶性多酚，被鉴定为迷迭香提取物的主要成分之一，具有抗氧化、抗炎、抗血栓生成、抗菌等生物活性，广泛应用于食品、医药、化妆品等领域。
目前，将RA或迷迭香提取物用于延缓肉类制品的脂肪氧化和蛋白质氧化已有报道。诸多研究表明，蛋白质与多酚类化合物之间的相互作用分为可逆的非共价相互作用和不可逆的共价相互作用，但因为蛋白质的高度复杂性、多酚的多反应活性、蛋白与多酚种类及反应条件的不同，其相互作用呈现出复杂性。目前，关于肉类蛋白与RA的互作研究大部分都基于氧化条件下对于蛋白凝胶特性的影响。而在非氧化条件下，肌球蛋白与RA在溶液体系中的相互作用及其与蛋白理化特性的内在联系的研究较少。
西南大学食品科学学院的周扬、陈雪珂和张宇昊*等人以肌球蛋白和RA为原料制备混合溶液，运用荧光光谱、圆二色谱、电泳等方法表征RA与肌球蛋白的相互作用，并测定不同盐浓度条件下肌球蛋白的构象变化和功能特性等指标，旨在探究溶液状态下RA与肌球蛋白的相互作用及其对肌球蛋白理化特性的影响，并阐明相关机理。
1荧光光谱分析
1.1色氨酸荧光结果可以通过研究蛋白的色氨酸荧光了解蛋白与多酚之间的相互作用。如图1A所示，当激发波长为nm时，肌球蛋白被激发后展现出很强的荧光强度。随RA添加量的增加，肌球蛋白的荧光强度逐渐降低，且伴随着最大发射峰出现明显的红移现象（从nm移至nm），说明RA对于肌球蛋白内源荧光具有明显的猝灭作用，二者可能通过相互作用促使蛋白结构展开，进而使色氨酸从蛋白内部疏水性位置暴露到极性环境中。采用经典Stern-Volmer方程对荧光数据进行分析。如图1B、表1所示，随温度升高，猝灭曲线的斜率（Ksv）逐渐降低，且猝灭常数Kq远大于最大动态猝灭常数（2.0×L/（mol·s）），说明RA引起的肌球蛋白荧光猝灭是分子之间结合形成复合物所引起的静态荧光猝灭，而不是由分子扩散和碰撞所引起的动态荧光猝灭。
1.2结合情况和作用力类型判断
结果显示，温度对肌球蛋白与RA的结合常数影响不大，Ka值均大于L/mol，且可形成一个结合位点，表明RA与肌球蛋白之间结合力很好。结果显示，通过反应的热力学参数的计算可大致确定作用力的类型。肌球蛋白与RA的作用过程是一个放热过程（ΔH＜0），熵增过程（ΔS＞0）及自发过程（ΔG＜0），且熵增加是肌球蛋白与RA相互作用过程的主要驱动力。在水溶液中，ΔS＞0，可认为二者之间主要的作用力为疏水作用。因此，肌球蛋白与RA之间以疏水相互作用为主，还包括氢键和范德华力等，如图2所示。
2表面疏水性分析
如图2所示，当NaCl浓度从0.2mol/L增加至0.6mol/L时，两组疏水性均呈显著减少的趋势（P＜0.05）。当NaCl浓度从0.6mol/L增加至1.0mol/L时，M组疏水性显著增加（P＜0.05），而M-RA组无显著变化（P＞0.05）。总体而言，添加RA导致肌球蛋白疏水性升高，说明RA可以促进肌球蛋白结构的展开，暴露埋藏在蛋白分子内部的疏水性基团。结合色氨酸荧光结果，进一步表明添加RA可以促使蛋白结构展开并暴露疏水性基团，从而利于肌球蛋白与RA发生疏水相互作用。
3总巯基分析
结果显示，当NaCl浓度从0.2mol/L增加至0.4mol/L时，两组总巯基含量均显著增加（P＜0.05）；NaCl浓度在0.4～1.0mol/L范围内，两组总巯基含量无显著变化（P＞0.05），说明此时NaCl浓度对蛋白巯基含量无显著性影响。总体而言，添加RA导致肌球蛋白总巯基含量下降。
为了进一步验证溶液体系中RA与巯基是否发生了相互作用，分析RA对肌球蛋白SDS-PAGE图谱的影响。如图4所示，肌球蛋白由大约kDa的肌球蛋白重链（MHC）亚基谱带和分子质量大约15～25kDa的3条肌球蛋白轻链（MLC）亚基，以及43kDa的肌动蛋白杂条带组成。在SDS-PAGE中，非还原条件下（-β-ME），随NaCl浓度的增加，两组蛋白分子组成无明显区别，在浓缩胶顶部均存在高分子聚合物。在还原条件下（+β-ME），这些聚合物得到分解，说明聚合物主要是通过二硫键交联产生。此外，MHC带处浓度明显减少，说明非还原条件下，该条带并非单纯的MHC组分，还包含了部分由二硫键交联形成的聚合物。与M组相比，还原和非还原条件下M-RA组图谱均无明显变化，也就是说所有聚合物是通过二硫键交联而非RA导致的共价交联所产生，说明肌球蛋白与RA之间作用以非共价作用为主，故在电泳条件下，SDS溶液可以破坏这些弱键，使得图谱没有明显差异。
4圆二色谱分析
如图5所示，两组肌球蛋白在nm和nm波长附近均出现2个强负吸收峰，表明螺旋结构的存在并作为二级结构的主要部分，随NaCl浓度增加，两组α-螺旋结构含量显著增加（P＜0.05），这可能是因为α-螺旋结构是由蛋白质的羰基（—CO）和氨基（NH—）之间的氢键所维持的，高离子强度下受静电屏蔽作用更有利于氢键的形成和稳定。
总体而言，添加RA后，肌球蛋白的α-螺旋含量降低，说明RA可以促进肌球蛋白双螺旋杆状尾部结构的解旋，导致肌球蛋白结构进一步得到展开，这与表面疏水性结果一致。此外，RA的羟基可与蛋白质多肽链的羰基形成氢键，这可能会破坏肌球蛋白分子内氢键平衡，从而破坏其稳定性。
5肌球蛋白与RA的互作机制
如图6所示，在溶液中，肌球蛋白与RA之间主要通过疏水相互作用结合，不存在共价相互作用，添加RA可以促进肌球蛋白结构展开，暴露出更多的活性基团，进一步利于肌球蛋白与RA之间发生疏水相互作用。肌球蛋白与RA之间的相互作用除了可以影响蛋白分子的结构特征，还可能会进一步影响其理化特性。
6溶解度和浊度分析
结果显示，当NaCl浓度从0.2mol/L增加至0.6mol/L时，两组的溶解度均呈显著增加趋势（P＜0.05），而浊度呈现相反变化趋势；随NaCl浓度增加，盐离子逐渐破坏肌球蛋白分子间静电相互作用，抑制丝状体的形成，蛋白分子表现为可溶性单体或寡聚体。当NaCl浓度高于0.6mol/L时，M组溶解度呈现微弱的下降趋势。总体而言，添加RA后，肌球蛋白的溶解度降低，浊度增加。
7Zeta电位和粒径分析
结果显示，Zeta电位为负值，表明肌球蛋白呈负电荷。随着NaCl浓度的增加，肌球蛋白Zeta电位的绝对值降低。总体而言，添加RA后，Zeta电位的绝对值明显降低。与肌球蛋白浊度的变化结果一致，在0.2mol/LNaCl下，肌球蛋白呈难溶性的细长丝状，蛋白分子聚集成团，故粒径较大；而随NaCl浓度的升高，聚集的蛋白分子经历先解聚再进一步解离的过程，并以可溶性单体形式存在，粒径显著减小（P＜0.05）。总体而言，添加RA后，蛋白粒径增加。此外，肌球蛋白与RA之间的相互作用对肌球蛋白电荷的屏蔽作用降低了蛋白稳定性，也会增大其粒径。
8乳化特性分析
结果显示，当NaCl浓度从0.2mol/L增加至0.6mol/L时，两组乳化活性和乳化稳定性均呈显著增加趋势（P＜0.05），当NaCl浓度高于0.6mol/L时，两组乳化性和乳化稳定性变化不明显。溶解度是影响蛋白乳化性的重要因素。随NaCl浓度增加，肌球蛋白的溶解度逐渐增大，蛋白能迅速移到油水界面形成界面膜参与乳化，进而提高了乳化活性；溶解度的增加还提高了分布在油水界面的蛋白质浓度，蛋白可以更好地包裹在油滴表面，从而增强了乳化稳定性。
添加RA后，0.2～0.4mol/LNaCl条件下，乳化活性和乳化稳定性明显降低。0.6～1.0mol/LNaCl条件下，虽然RA降低了肌球蛋白的溶解度，但乳化性没有明显差别，乳化稳定性差异也较小。在实际应用中，要考虑多酚类化合物或香辛料的种类及其使用量对产品功能性质的影响，避免对产品品质产生不良影响。
结论
本研究分析了溶液状态下肌球蛋白与RA之间的相互作用。色氨酸荧光结果表明，RA对肌球蛋白的内源荧光具有较强的静态猝灭作用，且RA与肌球蛋白主要通过疏水相互作用自发进行结合。总巯基和电泳结果表明，肌球蛋白与RA之间不存在共价交联。表面疏水性和圆二色谱结果表明，添加RA可以促进肌球蛋白结构展开，α-螺旋含量降低，更多活性基团暴露，表面疏水性增加。不同NaCl条件下，添加RA会降低Zeta电位的绝对值，导致肌球蛋白的溶解度降低，浊度和粒径增大。低盐浓度下（0.2～0.4mol/L），添加RA降低了肌球蛋白的乳化性，中高盐浓度时（0.6～1.0mol/L）时，RA对肌球蛋白的乳化性影响较小。本文《溶液体系中迷迭香酸与肌球蛋白的相互作用及其对蛋白理化特性的影响》来源于《食品科学》年41卷12期14-21页，作者：周扬，陈雪珂，戴宏杰，余永，朱瀚昆，王洪霞，张宇昊。DOI:10./spkx---。点击下阅读原文即可查看文章相关信息。近期研究热点
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